2.2.1. Tipos de esterilización
La esterilización
comprende todos los procedimientos físicos y preferentemente químicos, que s
emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta, los materiales
alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operaria.
Métodos físicos
Fuego directo
En
este método los materiales tienen contacto con el fuego directo del mechero,
principalmente se utiliza para las pinzas y bisturís.
Radiaciones
Su
acción depende de:
- El tipo de radiación
- El tiempo de exposición
- La dosis
Ionizantes
Producen
iones y radiaciones libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos,
estructuras proteicas, lipídicas y componentes esenciales para la viabilidad de
los microorganismos. Se utilizan a escala industrial por sus costos.
Rayos ultravioletas
Afectan
a las moléculas de ADN de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y s
e utilizan para superficies.
Rayos gamma
Su
empleo esta basado en los conocimientos sobre la energía atómica. Este tipo de esterilización
se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el
campo industrial.
Filtración
Se
usa membranas filtrantes como poros de tamaño determinado. El tamaño del poro
dependerá del uso al que va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan
no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están el límite de separación
según el diámetro de poro que se utilice.
Calor húmedo
El
calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de las proteínas. Estos
efectos se deben principalmente a dos razones.
El
agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son
producidas por reacciones que eliminan el agua.
El
vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho mas elevado
que el aire.
Para
la esterilización por este método se utiliza el autoclave o bien una olla de
presión, para el cultivo de tejidos vegetales se debe esterilizara a una
temperatura de 121°C a una presión de
1.2 kg/cm2 lo que equivale a 15 lb/pulg2 durante 20 min.
Figura 1. Autoclave.
Mufla
Una
mufla a combustible técnicamente es un horno para temperaturas elevadas donde
la fuente de calor esta separa totalmente de la cámara de cocción para que no
pueda contaminarse la muestra con los gases de combustión. Para esterilizar los
materiales para el cultivo de tejidos vegetales se esteriliza a 190°C por 2
horas.
Métodos químicos
Iodo
Es
un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos
nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidaciones de los grupos –SH a
S-S, pudiendo atacar también los grupos amino, índoles, etc.
Es
efectivo contra esporas en unan concentración de 1600 ppm de Iodo libre.
Alcoholes
Lesionan
la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas
celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica. No destruyen esporas y
tienen una acción germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un
efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan alcoholes con
concentraciones del 50% al 70%. Los más
utilizados son el etanol e isopropílico.
Órgano mercuriales
Estos
tipos de compuestos se combinan con los
grupos -SH de las proteínas, inactivando
enzimas. El dicloruro de mercurio es el más utilizado para el cultivo de
tejidos vegetales.
Aldehídos
Son
agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, lo que provoca modificación
irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática (Adición nucleofílica
de los grupos de los grupos –NH2 y –SH). Se utilizan como desinfectantes y
esterilizantes. Destruyen esporas.
El glutaraldehído es el único esterilizante
efectivo en frio. El formaldehido gaseoso se obtiene por calentamiento de paraformaldehído
(OH (CH2O) n-H), lo que produce la despolimerización de este compuesto y la
liberación del formaldehído. El formaldehido tiene la desventaja de ser muy
irritante y perder la actividad ambientes refrigerados.
Compuestos fenólicos
Son
desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque
desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa
filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis. El fenol no
es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy
irritante y por el residuo que queda luego de tratar las superficies.
Los
derivados del fenol mas utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles
(alquilfenoles). Estos son muy efectivos en bajas concentraciones contra formas
vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas.
Oxido de Etileno
Es
un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los
que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, etc. Este muy peligroso por
ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno.
Esterilización por gas-plasma de
Peróxido de Hidrogeno
Es
proceso de esterilización a baja temperatura la cual consta de transmisión de
peróxido de hidrógeno en fase de plasma (estado entre gas y líquido), que
ejerce la acción biocida.
Posee
como ventajas
- No deja ningún residuo toxico
- Se convierte en agua y oxigeno al final de proceso
- El material no precisa aireación
Desventajas
- No se pueden esterilizar los objetos que contengan celulosa, algodón, líquidos, humedad, madera o material con lúmenes largos y estrechos.
2.2.2. Factores
que intervienen en el proceso de esterilización.
Los
principales factores que intervienen en el proceso de esterilización son;
1.
Tiempo
2.
Presión
3.
Temperatura
Tiempo
El
tiempo al que exponemos el material a esterilizar es muy importante para
desinfectar el material, este depende en gran medida del método de
esterilización.
Presión
Este
factor es muy importante ya que muchas de los microrganismos contaminantes para
el cultivo de tejidos no soporta altas presiones, este factos es muy importante
cuando se esteriliza por el uso del autoclave o la olla de presión.
Temperatura
Las
altas temperaturas desnaturalizan las proteínas y por ende destruye a los
microrganismos contaminantes en los materiales y medio de cultivo.
2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos
Las
técnicas de cultivos asépticos han contribuido no solo a un mejor entendimiento
de los eventos de la diferenciación celular, sino e un mejor aprovechamiento de
tales eventos de la explotación mas eficiente de las plantas. En este ultimo
aspecto vale la pena mencionar los siguientes usos de las técnicas del cultivo
in vitro: mejoramiento genético, obtención de plantas libres de virus y otros
patógenos, conservación de germoplasma,
micropropagación.
Hasta
la fecha la micropropagación es una técnica que ha trascendido con éxito de los
ámbitos experimentales a la aplicación práctica.
2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos
El
cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explante y
termina con la obtención de plantas completa, lo que involucra una serie de
etapas los cuales difieren en gran medida dependiendo del autor que van de 3 a
5 etapas.
Etapa 0. Establecimiento de las plantas
donadoras (explantes)
La
elección de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen
los tratamientos, preparación y elección
de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible
comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad
(libre de patógenos, deficiencias y estrés).
Figura 2. Los explantes pueden ser de cualquier parte de la planta (hojas, tallos,
flores, frutos, etc.) o incluso células aisladas individuales.
Etapa 1. Instalación aséptica
Consiste
en la desinfección de los explante (generalmente con hipoclorito de sodio) y su
posterior adaptación al medio adaptación al medio artificial de modo de inducir
el callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar
la superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo
crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán
ventajosamente con el explante.
Figura 3. Una masa celular se forma llamado
callo embrionario para empezar a diferenciar tejido y convertirse en plántula.
Etapa 2. Multiplicación
Consiste
en generar la cantidad de masa vegetal
suficiente para la generación del número de plantas necesarias.
Figura 4. Nuevas plántulas.
Etapa 3. Enraizamiento
Es
el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a
loso brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento
puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso
se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de
reguladores de crecimiento que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza
en condiciones d esterilidad (en la campana de flujo). En el segundo caso los
brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un
sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una muestra de
perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro
deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben
realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y
formar raíces.
Figura 5. Formación de raíces.
Etapa 4. Adaptación a campo
Es
el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones
del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún
sustrato inerte.
Figura 6. Se trasplantan a macetas para su
adaptación. a campo.
2.3.2. Selección de plantas madres
El
estado fisiológico de la planta que dona el explante (planta madre) influye
significativamente en su capacidad morfogenética, se ha encontrado, por
ejemplo, los requerimientos nutricionales y hormonales difieren cuando los
tejidos cultivados provienen de diferentes edades fisiológicas.
La
posición de las yemas es un factor importante. Se ha observado por ejemplo, que
las yemas axilares de las rosas, obtenidas de la parte media del tallo, se
desarrollan mas rápidamente que aquellas obtenidas de la base o la porción
apical (Bressan et al., 1982) sin embargo, en el esparrago y la grosella las
yemas apicales son las únicas que producen ´plantas in vitro. En el caso de
especies propagadas vegetativamente, los brotes jóvenes han sido generalmente
la fuente del explante (Villalobos, 1980).
Figura7. Planta madre.
2.3.3. Explante
La
selección del explante puede hacerse teniendo en cuenta el sistema de
propagación de la planta. Si las plantas
tienen una reproducción por semilla, las parte embrionales o de la
plántula son las fuentes más comunes de explantes. En el caso de especies
propagadas vegetativamente, los brotes jóvenes y los ápices meristematicos han
sido generalmente la fuente de explantes.
El
tamaño del explante no tiene aparentemente mayor influencia. Solamente en el
caso de que se pretenda obtener plantas libres de virus, los meristemas (sin
primordios fóliales) tienen una alta probabilidad de diferenciar plantas libres
de estos patógenos; sin embargo, es mas difícil regenerar de ellos plantas
completas (Villalobos et al., 1982).
Figura 8. Explante en buen estado.
2.3.4. Siembra del explante
Una
vez seleccionado el mejor explante se requiere desinfectarlo superficialmente
para que en el medio de cultivo no crezcan microrganismos (hongos, bacterias)
que compitan con el explante. Para esta desinfección se han empleado diferentes
compuestos, siendo los mas comunes el las soluciones de hipoclorito de sodio y
calcio, el peróxido de hidrogeno, el nitrato de planta, el cloro comercial, el alcohol
a diferentes porcentajes, y otros. La selección y concentración del
desinfectante y el tiempo de desinfección se determinan en gran medida por las
características del explante; en la práctica se establecen principalmente por
ensayo y error.
Después
de desinfectar el explante se siembra en el medio de cultivo con ayuda las
pinzas procurando no introducir la mano al frasco y que la yema quede hacia a
riba, después de esto se cierra y se sella el frasco.
El
explante debe responder eficientemente bajo condiciones in vitro. Es importante
considerar el hecho de que el aislamiento de un tejido u órgano del resto de la
planta provoca un estado de estrés que altera su metabolismo celular y en forma
importante su balance hormonal. Un buen explante es aquella cuyas células
sobreviven en una alta porción, a la descomposición antes señalada, y que luego
responde eficientemente a las condiciones in vitro.
Figura 9. Siembra del explante.
2.3.5. Condiciones de incubación
Los
factores físicos juegan un papel determinante para el desarrollo del explante;
la luz y la temperatura han sido los factores mas extensamente estudiados. La
temperatura de incubación para la propagación de la mayoría de las familias
fluctúa entre los 24 y 28°C. Se han variado los regímenes de temperatura en el
día y en la noche, y se han encontrado que únicamente en un residuo número de
especies tal variación es ventajosa (Chee et al., 1982).
Recientes
investigaciones han probado que la luz en un factor fundamental en la
morfogénesis (Villalobos et al., 1984). Al respecto se ha observado, en el caso de Pinus radiata, que
la luz interacciona con una Citocinina durante la diferenciación de los brotes
adventicios y que la morfogénesis no ocurre cuando falta uno de esos dos
componentes. El papel de la luz en la diferenciación involucra varios
componentes como son la intensidad, el fotoperiodo y la calidad: aunque se
reconoce la importancia morfogenética de estos componentes, los estudios
realizados con el fin de analizarlos son escasos.
Figura 10. Condiciones idóneas para la incubación de los explantes.
2.3.6. Cambios fisiológicos del explante
Son
los muchos los cambios que sufre el explante durante el cultivo in vitro, pero
los más importantes son:
•
La cutícula más delgada
•
El parénquima se vuelve ineficiente
fotosintéticamente
•
Los estomas no funcionan al 100%
•
Las plantas sufren vitrificación
•
La epidermis esta desorganizada
•
Las raíces mueres por ser tan delgadas
Todos
estos cambios morfológicos hacen que el trasplante o la adaptación a campo sea
más difícil y existe mayor índice de mortalidad.
Figura 11. Las plantas cultivadas in vitro sufren varios cambios fisiológicos que
limitan su trasplante al sustrato.
2.3.7. Trasplante al sustrato
Consiste
en realizar el trasplante del medio de cultivo a un sustrato para su
maduración. Si
el sistema radical fue diferenciado in vitro las plantas no se pueden
trasplantar directamente a las condiciones de invernadero sin una paulatina
adaptación a las condiciones de suelo. A este periodo de adaptación se le ha
denominado periodo de endurecimiento.
Con
especies leñosas, anuales y suculentas, las plantas obtenidas in vitro se deben
lavar cuidadosamente para eliminar todos los residuos de agar, que puedan ser
una fuente de contaminación. Posteriormente, se trasplantan a recipientes con
suelo estéril y se cubren con bolsas de polietileno, que van perforando
gradualmente hasta que queden eliminadas completamente en un periodo de 15 a
20; esto se hace con el objetivo de adaptar paulatinamente las plantas a las
condiciones de invernadero. Durante esta fase de endurecimiento las plantas se
riegan preferentemente con medio de cultivo diluido al 50% y posteriormente se
sustituye esta formula de riego por soluciones nutritivas menos complejas.
Figura 12. Por último realiza el trasplante.
Bibliografía
- W.M. Roca, L.A. Mroginski. Cultivo de tejidos en la agricultura (fundamentos y aplicaciones). Publicación CIAT.
- http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/cultivos%20celulares%2011%20Euge.pdf
- http://www.minografias.com/trabajos10/meste/meste.shtml
- http:es.scribd.com/doc/63165567/estufa-mufla-y-autoclave
- http:www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminarioesterilizacion.htm
